Imunofluorescence, imunohistochemie
Imunofluorescence je imunologická metoda sloužící k průkazu antigenu nebo specifické protilátky. Jejím základem je vazba antigen-protilátka. Metoda se v určitých znacích podobá ELISA.
Imunofluorescence se provádí na podložním skle (v další fázi procesu se prohlíží ve fluorescenčním mikroskopu).
1. Přímá imunofluorescence
Přímou imunofluorescencí stanovujeme antigen. Vzorkem pro vyšetření jsou buňky, které na svůj povrch exprimují specifické antigeny. Toto je typické zejména pro virová onemocnění (viry donutí buňku syntetizovat antigeny a poté je distribuovat na membránu). Aby bylo možné vyšetření provést, musí být buňky snadno přístupné pro odběr (stěry mandlí, orofaryngu, konjunktivy...). Stěr musí být proveden dostatečně silně, aby došlo k odloupnutí buněk ze sliznice.
V laboratoří jsou buňky přesunuty na podložní sklo, kde se na ně nechá působit roztok specifických protilátek značených fluoresceinizothiokyanátem (FITC), případně rhodaminem. Je-li na povrchu buňky přítomen antigen, dojde k vazbě protilátky. Fluorescein vystavením světlu vhodné vlnové délky světélkuje. V mikroskopu tedy vidíme pozitivní buňky zářit zvítivou barvou (dle zvoleného barviva, v případě fluoresceinu zelená).
2. Nepřímá imunofluorescence
Nepřímou imunofluorescencí můžeme prokazovat jednak přítomnost antigenu, ale také specifické protilátky. Vizualizace se opět realizuje osvícením preparátu světlem o vhodné vlnové délce ve fluorescenčním mikroskopu.
A. Průkaz antigenu
Pro průkaz antigenu je postup stejný jako při přímé imunofluorescenci. Jediným rozdílem je, že primární protilátky nejsou značené (nejsou komernčně dostupné), a tedy pro vizualizaci musíme navázat protilátky, proti specifickým (primárním) protilátkám, které již značené jsou. Jsou-li tedy primární protilátky lidské, použijí se v dalším kroku značené protilátky proti lidským protilátkám.
B. Průkaz protilátek v séru
Nemoci lze diagnostikovat přítomností specifických protilátek v séru. Vzorkem tedy nebude stěr ze sliznice, nýbrž krevní sérum. Na podložním skle jsou již nachystány buňky se specifickým antigenem (antigenní substrát). Na tyto se nechá působit sérum. Jsou-li přítomny specifické protilátky, dojde k jejich navázání. Vizualizace se opět provede značenými protilátkami proti navázaným protilátkám (jsou-li primární protilátky lidské, sekundární budou protilátky proti lidským protilátkám). Metoda nepřímé imunofluorescence pro průkaz protilátek se využívá zejména v diagnostice autoimunitních chorob.
Imunohistochemie je metoda prakticky shodná s imunofluorescencí, akorát místo stěru buněk ze sliznice se při vyšetření používá histologický preparát tkáně. Metoda se používá pro průkaz antigenu exprimovaného na buňkách. Oproti imunofluorescenci zde odpadá potřeba přístupnosti místa, ze kterého je odebírán vzorek. Ovšem pacienta je nutno vystavit invazivnímu výkonu, jedná-li se o biopsií získaný vzorek. Metoda se hodí pro diagnostiku post mortem, kdy se během pitvy odeberou vzorky postižených tkání.