ELISA
Enzyme linked immunosorbent assay, tedy zkráceně ELISA, je imunologický test pro průkaz protilátek v séru nebo pro průkaz antigenu. ELISA je založena na vazbě protilátky s antigenem. Neznámé antigeny se testují známou protilátkou, neznámé protilátky se testují známým antigenem. Celá reakce i její zviditelnění se dějí v jamce mikrotitrační destičky. Komerčně dostupné ELISA testy mají velké množství jamek, což umožňuje vyhodnocování několika desítek vzorků najednou.
ELISA má celkem čtyři složky:
1. Antigen (testovaný / známý)
2. Protilátka (testovaná / známá)
3. Konjugát - protilátka proti antigenu nebo protilátce, která je konjugována s enzymem (alkalická fosfatáza, křenová peroxidáza)
4. Substrát - látka, která je měněna enzymem konjugátu. Při změně struktury látky zároveň dochází ke změně barvy.
Na obrázku se nachází schématický průřez jamkou mikrotitrační destičky a tři možné modifikace ELISA:
1. Přímá ELISA
Přímá ELISA slouží k přímému průkazu antigenu. Antigen je tedy v tomto případě neznámý a testujeme jej známou protilátkou (konjugátem). Antigen může adherovat přímo na materiál jamky, nebo častěji na protilátku, jež je na tomto materiálu navázána. Po navázání antigenu na potilátku (resp. přilnutí k jamce) následuje promytí, které odstraní z jamky vše ostatní kromě antigenu. Následně se přidá konjugát, což je v tomto případě specifická protilátka proti antigenu vázaná s enzymem. Po dalším promytí je do jamky přidán substrát. Je-li reakce pozitivní, dojde ke změně barvy (reakce substrátu s enzymem). Nebyl-li antigen ve vzorku přítomen, nedošlo k jeho vazbě, a tedy ani konjugát se nemohl navázat. V jamce se tedy nenachází enzym a reakce je negativní.
Prakticky se přímá ELISA příliš nevyužívá, jelikž je komerně dostupných jen velmi málo specifických protilátek, které jsou již konjugovány s enzymem (vzhledem k množství testovaných antigenů by bylo velice nepraktické pro každý antigen vyrábět specifické konjugáty).
2. Nepřímá ELISA
Nemáme-li k sispozici proti testovanému antigenu specifickou protilátku vázanou přímo s konjugátem, musíme si vypomoci jinak. Stejně jako u přímého testu necháme navázat antigen na plochu jamky. Po promytí však nenecháme navázat konjugát (nemáme ho), ale klasickou protilátku (primární neznačená protilátka). Tato protilátka není značená enzymem, aby tedy bylo možné reakci zviditelnit, navážeme ještě jednu protilátku (sekundární značenou), a to protilátku proti již navázané protilátce. Již navázaná (primární neznačená) protilátka tedy působí jako antigen pro sekundární značenou protilátku - konjugát. Další postup je již stejný jako v předchozí metodě, kdy přidáním substrátu zjistíme přítomnost enzymu (tedy konjugátu) a tím i testovaného antigenu.
Základní princip nepřímého testu vychází ze znalosti druhu, jemuž primární neznačená patilátka patří (protilátky králičí, morčecí, prasečí, koňské...). Proti druhovým (primárním neznačeným) protilátkám se vyrábějí protilátky sekundární, které se již konjugují s enzymem. Vzhledem k tomu, že používaných druhových (primárních neznačených) protilátek je výrazně méně než testovaných antigenů, je rzumnější vyrábět konjugáty proti těmto druhovým protilátkám.
3. Sendvičová ELISA
Sendvičová ELISA je modifikovaná nepřímá ELISA. Stejně tak jako v případě přímého testování se příliš nepoužívá vazba antigenu přímo na materiál jamky, i zde se preferuje vazba antigenu na protilátky, které jsou vázané na ploše jamky. Postup se prakticky neliší od nepřímého testu. Sendvičová ELISA je testem první volby například pro diagnostiku slintavky a kulhavky (SLAK).