Ze světa nejmenších rozměrů

Očkováním - inokulací - živné půdy rozumíme nanesení určitých mikroorganismů na sterilní živnou půdu za účelem jejich pomnožení a dalšího zkoumání. Postupným vyřeďováním inokula na pevných půdách lze docílit separace jednotlivých buněk, které pak tvoří izolované kolonie. Tyto pak lze subkultivovat a podrobit další diagnostice.

Očkování kapalného média

Kapalná média jsou určena pro pomnožení bakterií. Jsou připravena v bakteriologických zkumavkách uzavřených speciální zátkou nebo vatovou zátkou. Očkování provádíme tak, že přeneseme malou část materiálu do živného média, kde materiál rozmícháme. K přenosu používáme nejčastěji bakteriologickou kličku, méně často pak pipetu. Postup očkování je následovný:

1. Na pracovním pole je připraveno vše podstatné k práci - bakteriologická klička, materiál, který chceme očkovat, živné médium, zapálený kahan.
2. Kličku uchopíme do pravé ruky způsobem, jakým se drží psací potřeby. Vyžíháme v oxidačním plameni kahanu do rozžhavení kličky. Stejně tak lehce ožíhneme držák kličky po celé délce, která přijde do prostoru zkumavky.
3. Nabere se na kličku malé množství materiálu, který má být očkován.
4. Zkumavku s médiem uchopíme do levé ruky.
5. Malíkem pravé ruky uchopíme zátku sevřením mezi prst a dlaň a zvolna ji vytáhneme ze zkumavky. Hrdlo zkumavky lehce ožíhneme v plameni kahanu.
6. Zanoříme kličku s materiálem do živného média a lehce promícháme. Kličku vyjmeme.
7. Hrdlo zkumavky opět ožíhneme v plameni a uzavřeme zátkou (zátka je stále svírána mezi malíkem a dlaní pravé ruky, neodkládá se na stůl).
8. Zkumavku na moment uložíme do stojanu a vyžíháme kličku. Po této proceduře můžeme kličku odložit (již nemůže kontaminovat prostředí).
9. Zkumavku popíšeme údaji jako datum inokulace a inokulovaná bakterie.

Očkování na tuhá média ve zkumavce

Při očkování na tuhá média ve zkumavce se rozlišuje, zdali se jedná o šikmý agar (ztuhlý v šikmé poloze) nebo o vysoký agar (ztuhlý v kolmé poloze). První varianta je určena k očkování na plochu vzniklou utuhnutím agaru v šikmé poloze, druhá varianta je určena k naočkování vpichem.

Zleva šikmý a vysoký agar

Postup očkování je stejný jako očkování do kapalných médiií s rozdílem v konečné fázi. V případě šikmého agaru je klička zanořena až do prostoru, kde agar se stěnou zkumavky svírá úhel, a kličkou je kreslen had ze strany na stranu až po vrchní hranici agaru se stěnou zkumavky. V případě vysokého agaru provádíme očkování pomocí bakteriologické jehly tak, že jehla s naneseným materiálem proniká skrze agar až téměř ke dnu. Inokulace na tuhá média ve zkumavkách se hodí pro sledování vlastností bakterií z čisté kultury (vizte níže). Na šikmém agaru lze pozorovat rychlost růstu, tvar kolonie a případně změny média (TSI agar). V agarovém vpichu sledujeme rychlost růstu, tvar růstu, v semisolidních agarech pohyblivost bakterií (bakterie se rozrůstají nejen ve vpichu, ale migrují i do stran a kolonizují celý objem semisolodního agaru) a jejich vztah ke kyslíku (obligátně aerobní pouze ve vrchní třetině, obligátně anaerobní pouze u dna, fakultativně anaerobní po celé délce vpichu a mikroaerofilní pouze v určité malé oblasti vpichu, kde je koncentrace kyslíku přesně v úzkém spektru vyžadovaném danou bakterií). V želatinovém vpichu navíc lze sledovat i schopnost ztekucování želatiny.

Očkování mikrobiologické plotny

Mikrobiologickou plotnou se rozumí ztužená živná půda nalitá v Petriho misce. V takovém případě provádíme nejčastěji tzv. křížový roztěr, čímž vzorek postupně zřeďujeme a umožníme tak vznik samostatných kolonií. Při očkování ploten postupujeme následovně:

1.  Na pracovním poli jsou připraveny: mikrobiologicá plotna, bakteriologická klička, zapálený kahan a materiál, jenž bude očkován.
2. Do pravé ruky uchopíme kličku a sterilizujeme obvyklým způsobem v oxidační části plamene kahanu.
3. Po vychladnutí kličky nabereme na malé množství materiálu. Misku nebo nádobu se vzorkem ihned uzavřeme.
4. Lehce nadzvedneme levou rukou víko Petriho misky (pouze nadzvedneme - víko se stále nachází nad miskou) a naočkujeme vzorek na plotnu. Ihned poté Petriho misku přiklopíme a kličku sterilizujeme plamenem.

Metoda křížového roztěru slouží k vyřeďování vzorku a k osamocení kolonií. Spočívá v křížovém roztírání mikroorganismů podle schématického obrázku níže. Šipky určují směr roztěru v jednom kroku. Při vyřeďování je nutné kličku sterilizovat. Sterilizace se provádí mezi prvním a druhým a druhým a třetím tahem (na obrázku čísla 1 a 2). Při kreslení ocásku (číslo 3) jež kličku nesterilizujeme. V případě vzorků s hojnějším výskytem bakterií můžeme provést ještě jednu sérii tahů navíc (tedy v bodě 3 nebudeme kreslit hada, ale místo toho kličku vysterilizujeme a nakreslíme čtvrtou sérii tahů. Hada poté nakreslíme opět bez sterilizace z této čtvrté série).

Schéma křížového roztěru: 1, 2: kličku sterilizovat, 3: kličku nesterilizovat

Pakliže provádíme první kultivaci ze vzorku, kde se nachází více druhů bakterií, vyrostou v oblasti dostatečného vyředění různé kolonie (různá morfologie). Každá izolovaná kolonie vznikla z jediné buňky, tedy každá taková kolonie obsahuje buňky pouze jednoho rodu - dosáhli jsme tedy separace bakterií. V následujícím kroku, chceme-li zkoumat vlastnosti bakterií, je nutné provést subkultivaci. Sterilní kličkou přeneseme bakterie z jedné izolované kolonie na nový agar, kde ji výše popsaným způsobem vyředíme. Po inkubaci takto získáme čistou kulturu bakterií.