Ze světa nejmenších rozměrů

Stanovení bakteriální citlivosti k antibiotikům je důležitým aspektem v léčbě bakteriálních infekcí. Testování cistlivost, resp. rezistence, se provádí in vitro v laboratoři u izolovaného a identifikovaného kmene.

Pro pochopení postupů stanovení antibiotické rezistence je nutné si vysvětlit několik pojmů:

Minimální inhibiční koncentrace (MIC): je taková koncentrace antibiotika (mg/l), která ještě zastavila množení bakterií

Minimální baktericidní koncentrace (MBC): je taková koncentrace antibiotika (mg/l), která bakterie v testovaném vzorku zabila

Breakpoint: je hodnota stanovena EUCAT (nadnárodní organizaece), která definuje koncentraci, při které je daná bakterie na dané antibiotikum rezistentní, či nikoli.

Při stanovení bakteriální rezistence na ATB se pracuje s izolovaným a identifikovaným kmenem bakterií. Aby bylo testování objektivní, je nutné testovat stanovený počet bakterií. Prakticky se toto realizuje vytvořením suspenze bakterií v pufrovaném fyziologickém roztoku o určitém zákalu (měřeno fotometricky). Stendardně se k měření a standardizaci zákalu používá McFarlandova stupnice.

Bujón diluční metoda

Bujón diluční metoda je kvantitativní metoda, kterou se měří hodnota MIC. Ta je následně porovnána s breakpointem, podle kterého je rozhodnuto, zdali je bakterie k danému ATB citlivá (MIC je nižší než breakpoint) nebo rezistentní (MIC je vyšší než breakpoint).

Připraví se řada zkumavek s živným bujónem, který se obohatí ATB, a to tak, že každá další zkumavka bude obsahovat dvojnásobnou koncentraci ATB - tzv. dvojkové ředění (tedy např. řada zkumavek s koncentracemi 0,250 - 0,500 - 1,00 - 2,00 - 4,00 - 8,00 mg/l). Zkumavky s obohaceným bujónem se inokulují příslušným množstvím suspenze bakterií a celá sestava se nechá inkubovat.

Vyhodnocení probíhá od zkumavky s nejvyšší koncentrací antibiotka k nejnižší. Koncentrace ATB v poslední zkumavce, ve které ještě nevznikl zákal, odpovídá MIC.

Dnes se již metoda ve zkumavkách běžně nepraktikuje, ale používají se mikrotitrační destičky. Destičky nabízejí práci s malým objemem, takže jsou úspornější. Zvyšuje se taky přehlednost, jelikož na jedné destičce je možné testovat několik antibiotik zároveň, test je tedy situván do jedné destičky, nikoli do několika desítek zkmumavek.

Potřebujeme-li získat hodnotu MBC, je bujón diluční metoda prakticky jedinou, kterou lze aplikovat. V bujónu s ATB, kde nedošlo k pomnožení bakterií mohly nastat dvě situace, a sice buď došlo k zabití bakterií, nebo daná koncentrace ATB bakterie neusmrtila, ale zabránila v jejich množení. V obou případech vidíme negativní výsledek (resp. výsledek může být vnímán jako pozitivní - došlo k inhibici růstu, záleží na úhlu pohledu). Hodnotu MBC získáme vyočkováním všech negativních zkumavek na agarové médium bez obsahu ATB. Pokud byly bakterie v bujónu pozabíjeny, není z čeho na agaru vytvořit kolonie. Pokud došlo pouze k zastavení množení, ale bakterie přežily, přítomnost čistého média jim již nebude bránit a bakterie se začnou opět množit, což se projeví vznikem kolonií. Nejnižší hodnota koncentrace ATB v bujónu, ze kterého po vyočkování na agar nevznikly kolonie, je hodnota MBC.

Agar diluční metoda

Agar diluční metoda je de facto shodná s bujón diluční metodou, jen ATB není rozmícháno v bujónu, ale v agarové plotně.

Diluční metody jsou sice kvantitativní, tedy přesnější, avšak poměrně náročné, přestože bujón diluční metoda se realizuje v mikrotitračních destičkách. Z těchto důvodů se tyto metody používají spíš výjimečně.

Disková difuzní metoda

Disková difuzní metoda je o poznání jednodušší než metody diluční, avšak jedná se o metodu semikvantitativní, tedy méně přesnou.

Disková metoda se provádí na Muller-Hintonově agaru. Pro tyto účely nelze použít běžných agarů, neboť obsahují inhibitory sulfonamidů. Na agar se nanese rovnoměrně suspenze bakterií a nechá se zaschnout. Jakmile je připravena tato inokulovaná plotna, nanesou se na ni malé disky ze savého papíru, které jsou napuštěny určitým antibiotikem a nechá se inkubovat.

Bakterie jsou na plotně inokulované tak hustě, že kolonie vytvářejí souvislý povrch po celém agaru (dotýkají se až spolu splývají). Během inkubace však také difunduje antibiotikum z disku do agaru. Koncentrace difundovaného ATB je nepřímo úměrná vzdálenosti od disku (u disku bude obsah nejvyšší, se zvyšující se vzdáleností od disku se do agaru dostává méně ATB). V určitém místě dosáhne koncentrace ATB hraniční meze, která již nebude schopna inhibovat množení bakterií (MIC). Tato hranice definuje tzv. inhibiční zónu kruhového tvaru. Uvnitř zóny bakterie nerostou (koncentrace ATB je zde nad MIC), za hranicí zóny bakterie normálně prosperují.

Vyhodnocení se provádí změřením průměru inhibičních zón v milimetrech. Průměr je potom porovnán s referenční tabulkou, která udává od jakého průměru je daná bakterie považována za citlivou ke konkrétnímu ATB. Teoreticky by bylo možné převést průměry zón na hodnoty MIC, ale tento převod by byl nepřesný, proto jsou referenční tabulky přizpůsobeny pro přímé porovnání průměrů.

Určitou modifikací difuzní metody je E-test. Jedná se o proužek savého papíru, který je nasycen ATB, avšak se snižující se koncentrací (na jednom konci proužku je koncentrace ATB nejvyšší, na opačném konci nejnižší). Pro vyhodnocení jsou na proužku natištěna čísla, která odpovídají MIC. ATB během inkubace difunduje do agarové půdy se stejným gradientem, jako je gradient koncentrací ATB v proužku. Utváří se tedy inhibiční zóna ve tvaru kapky, jejíž hrot se v určitém místě dotkne proužku. V místě, kde se tak stalo, se z proužku odečte hodnota, která odpovídá MIC.

Disková difuzní metoda je nejčastěji využívanou k určení citlivosti bakterie k ATB. Leč je méně přesná, vyhrává pro svou nenáročnost. Na jedné agarové plotně lzde zkoušet i několik ATB. E-test sice poskytuje exaktnější výsledky při zachování jednoduchého provedení, avšak často se nepoužívá pro vysokou cenu.